Les méthodologies ELISA sont pour les autorités réglementaires « la gold méthode standard » pour suivre la suppression des HCP durant le downstream process.
Il est également demandé par les autorités de réaliser une analyse COVERAGE des anticorps anti-HCP contenu dans le HCP kit ELISA utilisé pour le dosage. Cette analyse appelé COVERAGE est une estimation du pourcentage des protéines HCP détectées (ou recouvertes) par les anticorps du kit ELISA (anticorps anti- HCP process-spécifique ou anticorps anti-HCP générique kit).
Plusieurs techniques sont disponibles pour mettre en place cette analyse COVERAGE et il est recommandé d’utiliser des techniques en 2D.
Agro-Bio réalise une analyse COVERAGE sur-mesure
Host Cell Protein (HCP) coverage évaluation : quand la réaliser?
Quel type d’analyse HCP COVERAGE est réalisé chez Agro-Bio ?
En interne, nous pouvons réaliser deux méthodes différentes pour l’analyse COVERAGE HCP : COVERAGE par 2D-DIBE et COVERAGE par purification sélective des HCP (PSP). Toutes deux reposent sur une approche d'électrophorèse bidimensionnelle (2D), permettant d'avoir sur un gel une cartographie exhaustive des HCP sous forme de spots (migration des protéines en fonction de leur point isoélectrique (pI) et de leur taille). Ces spots protéiques sont ensuite révélés par coloration ou par exploitation d'un marquage fluorophore (Cy2, Cy3, ...).
Le choix de la méthode COVERAGE d'un projet est déterminé par notre équipe scientifique en fonction : du contexte, de la quantité disponible d’anticorps, des objectifs, … Par exemple, l’analyse de COVERAGE par PSP (purification sélective des HCP), consomme beaucoup anticorps anti-HCP, ce qui est un facteur limitant pour certains projets.
Comment est calculé le pourcentage de COVERAGE (%) ?
Pour estimer le pourcentage de coverage, nous calculons le nombre de spot présents sur la membrane (représentant le pattern des HCP) qui sont reconnus par les anticorps anti-HCP générique ou les anticorps anti HCP process-spécifique.
Dans le cas d’un COVERAGE en 2D-DIBE, il y a une analyse en premier du signal de la coloration ou du marquage des HCP totales, puis du signal de l’Anticorps secondaire révélant l’Ab commercial ou process-spécifique.
Dans le cas d’un COVERAGE dit PSP, il y a aussi en premier, le signal de la coloration ou du marquage des HCP totales, puis une seconde analyse du signal de la coloration ou du marquage des HCP récupérées après purifications sur une colonne où sont greffés les anticorps anti-HCP.
Pour ces calculs de COVERAGE, le logiciel MelanieTM9 de Cytiva® est utilisé. C’est une solution complète pour la visualisation, la détection, et l'analyse d'images de gel et de membrane 2D. Il a été spécialement conçu pour l'analyse COVERAGE afin d’analyser les HCP issues de bioproduction. Grâce à sa vue 3D, il minimise les faux positifs, et permet d’améliorer l’analyse. Également, il permet d’évaluer les performances des anticorps anti-HCP avec un calcul du COVERAGE dans les 4 quadrants du gel.
